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土壤研究
使用土壤溶液取样器监测猪生产活动对土壤影响

       本研究旨在确定源自猪场的生物污染物是否传播到土壤和地下水微生物群落中。 在猪生产农场附近进行土壤和地下水的空间和时间采样,利用定量PCR(Q-PCR)测定四环素抗性基因(即tetQ和tetZ )和整合酶基因(即intI1 )的丰度和intI2 )。 
       我们观察到肥料施用后土壤中tetZ , tetQ ,intI1和intI2的丰度增加至少6倍,并且它们的丰度在高于16个月的背景下仍然升高。 Q-PCR进一步测定了位于粪肥泻湖旁边和供水良好的地下水井中tetZ , tetQ , intI1和intI2的总丰度高达5.88×10 9copies / ng DNA为其中一个农场。 
       我们进一步利用基于16S rRNA的焦磷酸测序来评估微生物群落,并且我们的比较分析表明,粪肥施用前后收集的大部分土壤样品没有显着变化,共有高达78.5%的Bray-Curtis相似性。 相反,在从泻湖相关地下水井采集的地下水中观察到类杆菌和硫氧化细菌种群的增加。 在一些经粪便处理的土壤和受影响的地下水井中检测到与机会性人和动物病原体相关的属,例如不动杆菌属 , 弓形 杆菌 属 , 耶尔森氏菌属和柯塞 氏菌属 。 在粪肥,土壤和地下水生态系统中检测到与粪便相关的细菌,如链球菌 , 丹毒丝菌和类杆菌 ,表明来自猪生产活动的入侵物种对土壤和地下水环境造成了扰动。
       在过去的25年里,养猪生产已经从小规模的综合养殖系统转变为可容纳数千种动物的浓缩动物饲养操作(CAFOs),每头猪通常每个生产周期生产约1,500千克粪肥。 仅在2012年9月,美国就生产了6750万头生猪和猪,产生了1.0×10 11公斤的新鲜粪便。 在施用到农作物作为肥料之前,粪肥通常储存在废弃的泻湖中。 在这个阶段,粪便相关的污染物会渗入土壤床层,污染地下水,并通过泄漏的泻湖内层渗入地下水。 此外,CAFO产生的粪便含有粪便相关的微生物群,其中一些成员可能是机会性病原体,当公众通过粪 - 口途径暴露于这些细菌群体时施加健康问题。 此外,畜牧业常规使用抗   生素治疗和预防疾病并促进生长。 以这种方式使用抗生素可以选择猪的胃肠道中的抗生素抗性细菌,并且来自这些细菌的抗性基因可以在猪生产农场附近分散到土壤和地下水中。
       进一步加重问题的是,粪便,土壤和地下水微生物群落成员之间存在的移动遗传因子,如整合酶基因,将有助于水平转移遗传性状。 最近对600多种完全或部分测序的细菌基因组进行的调查显示,其中约10%含有已知整合子。 这些整合子可能含有编码抗生素和重金属抗性等特性的基因盒和其他毒力决定簇。 水平基因转移现在被认为在微生物进化和适应中发挥重要作用,特别是与人类和动物健康威胁相关的特征。 由于水平基因转移可以有效扩大常驻土壤和地下水细菌的基因库,重要的是要了解来自生猪生产活动的生物污染是否会影响移动遗传因子的丰度及其在环境中的持久性。
       过去的研究利用基于文化和分子生物学的方法揭示,当粪肥施用于土壤微环境时,土壤中的抗生素抗性基因和移动遗传元素持续长达6个月。 此外,反复施用粪肥导致生物污染物的积累。 然而,这些研究仅限于实验室进行的微观世界,并没有反映在不受控制的环境背景下的摄动程度。 例如,生物污染物可能暴露于紫外线照射或当地天气条件下,这会影响它们的实际持久性和最终传播。 尽管过去的研究试图通过测量猪生产农场附近的地下水中抗生素抗性基因的丰度来解决这一局限性,但没有提供关于集体土壤和地下水微生物群扰动程度的进一步见解,来自生产农场的污染事件。
       本研究旨在确定源自猪场的生物污染物是否传播到土壤和地下水微生物群落中。 监测了靠近养猪场的土壤和地下水中四环素抗性基因(即tetQ和tetZ )和活动遗传因子(即intI1和intI2 )的丰度。选择四环素耐药基因是因为四环素仍然是养猪场最常用的抗生素之一。 整合酶基因的丰度提供了这些生态系统中微生物群落之间水平基因转移可能性的见解。 基于四环素抗性基因和整合酶基因的丰度,鉴定了受生猪活动影响较大的土壤和地下水样品。 然后进行基于16S rRNA的焦磷酸测序来比较检查土壤和地下水样品中的微生物群落并确定与机会病原体相关的属的存在。
       

材料和方法

 

  本研究确定了总共三个猪生产场所,这里称为场所ACE. 先前已经描述了地点AC的操作和地点水文地质( 17,18 )。 简而言之,A站点是一个4000头猪的整理操作。 该设施采用两阶段废物处理系统,其中一个混凝土沉淀池收集大部分固体肥料,之后上层清液被动地移入无衬砌的泻湖中。 场地C是一个分娩和苗圃操作,可容纳2,500头母猪。 C地点的设施使用一个单级无衬里的泻湖。 环礁湖的水被回收利用,部分填充并冲洗封闭建筑物下方的浅坑。 E场地是一个使用深坑泻湖的2,300尾肥育场( 5 )。 所描述的粪肥管理策略在整个采样过程中始终保持不变,从2005年到2010年。在所有场所,首先将肥料混合在泻湖中施用粪肥。 混合粪便然后通过柔性管道从泻湖直接泵送到拖拉机,粪肥从该拖拉机直接注入土壤(I. Krapac,个人通信)。 对于1所示的每个采样时间序列,肥料作为单一剂量施用,并且在整个采样期间在该特定区域不进行后续施用。 在所有三个地点使用金霉素进行疾病治疗,预防和生长促进。 确切的使用量不是由农民提供的。 由于与生产商签订了保密协议,这些设施的地理位置无法披露。
 土壤溶液取样器监测猪生产活动对土壤影响

土壤样本是在2005年至2007年间从三个农作物田地收集的,这些农田应用A,C和E地点(猪场生产农场)提供的粪肥。 每个时间序列的第一个采样点以粗体突出显示,这也表示土壤样本是在施肥之前收集的。 随后的采样点和距第一个采样点的空间距离表示施加粪肥后的时间。 粪肥作为单一剂量施用,并且在整个采样时间序列中没有在该特定区域进行后续施用。

   每个猪场设施都将粪肥施用于当地农田,并且在每个设施( n = 6个田地)的两个田间进行时间序列研究,以量化随后土壤中抗生素抗性基因,整合酶基因和微生物群落组成的变化在2005年至2007年期间施用粪肥。六个田地中的每一个都作为时间序列的一部分进行采样,该时间序列在肥料施用之前开始,然后定期持续216个月( 1 )。 在每个0.16平方公里的作物田上构建4×4网格,以形成每场16个网格节点。 在每个网格节点处,通过使用手芯,在距离网格节点1m处的四个土壤样本被收集在020cm的深度处。 从网格节点收集的所有样本混合形成一个复合样本,该样本将代表该局部网站的单个采样点( 1 )。 2005年至2007年的整个过程中共收集到28个复合土壤样品。之前的地质水文调查表明,E地的当地居民利用地下水作为水资源( 5 )。 因此,20106月(行程a)和20107月(行程b)启动了两次E地点采样,以采集地下水样本。 每次旅行时,从废水泻湖采集500毫升粪便泥浆,并从各个设施井和监测井E1E4E6E7 2 )收集1升地下水样本。 该设施井深36.6米,监测井的深井深度从砂岩5.37.1米不等。 根据先前描述的程序( 17,22 ),共收集10个地下水和2个粪肥样本,但设施井的地下水除外。 设施井中的地下水是通过与设施连接并位于设施办公室内的水龙头采集的。 在采集水样之前打开水龙头冲洗地下水约3分钟。 设施井和监测井E1都是废水泻湖的向上梯度,因此可作为阴性对照,其中不会产生来自废水泻湖的生物污染物。 相反,监测井E4E6E7直接与废水泻湖相邻,预计会受到潜在污染事件的影响。
土壤溶液取样器监测猪生产活

 

E猪生产农场的地下水井地图。 地下水井的位置用黑色圆圈表示,括号内的数字是井深(m)。 废弃的泻湖上方有一座动物禁闭大楼。 大型空心箭头表示地下水流向。 根据地下水流向和废水泻湖附近的方向,监测井E1和设施可以很好地作为背景井,在那里污染最少。 右边相应的地层柱表示砂层的特征。
    
基因组DNA提取和条形码PCR

   将地下水样品在0.22-μm聚碳酸酯膜(MilliporeBillericaMA)上过滤,并使用修改的方案提取基因组DNA 23 )。 通过使用用于土壤的FastDNA Spin试剂盒(MP BiomedicalsSolonOH)从土壤样品中提取基因组DNA 通过在1%十六烷基三甲基溴化铵和0.7M NaCl的溶液中于65℃孵育15分钟,然后用24:1氯仿 - 异戊醇提取,乙醇沉淀,并用乙醇沉淀再悬浮于65℃15分钟来进一步纯化潜在PCR污染物的土壤DNA Tris-EDTATE)缓冲液。 为了进行扩增子焦磷酸测序,通过使用通用正向519F5'-融合A-条形码-CAGCMGCCGCGGTAATWC-3')和反向926R5'-融合)从基因组DNA扩增16S rRNA基因的V4-V5区域B条形码-CCGTCAATTCMTTTRAGTT-3')引物。 PCR混合物包含10ng基因组DNA25ml预混物FEpicentre BiotechnologiesWI),200nM(各)正向和反向引物以及0.5U Ex Taq DNA聚合酶(TaKaRa Bio,日本),其体积为带有分子生物学级水的50毫升。 30个循环的热程序(变性,95℃30;退火,55℃45;延伸72℃60秒)进行PCR,从凝胶中切下扩增子,浓缩并用Wizard DNA纯化试剂盒(PromegaMadisonWI)纯化。

    焦磷酸测序和数据分析。

   配对末端焦磷酸测序由伊利诺伊大学的Roy J. Carver生物技术中心进行。共获得239,62416S rRNA序列(即16S pyrotags)(参见补充材料中的表S1)。 基于之前描述的程序( 24 )检查原始序列读数的质量,并且针对每个样品获得大约5,990个序列的焦磷酸测序深度。在95%置信水平下,RDP分类器被用于16S pyrotags的分类学分配( 25 )。 通过Primer-E v5.2.4进行具有平方根变换的Bray-Curtis相似性矩阵分析。 基于先前描述的程序( 24 )生成稀释曲线(参见图S1AE),并且在2300个标记深度处鉴定的操作分类单元(OTU)的数量被指出用于比较微生物丰度(参见表S2) 。

   四环素抗性基因和整合子基因的Q-PCR分析。

   引物TetQTetZ靶向四环素抗性基因,分别编码核糖体保护蛋白和外排泵(见补充材料表S3)( 26,27 )。 引物IntI1IntI2分别靶向整合子类别12(见表S3)( 28 )。 对所有土壤,地下水和粪便样品进行定量PCRQ-PCR)。 基于先前描述的方案( 24 )制备反应混合物。 从标准曲线获得的tetQ  tetZ  intI1  intI216S rRNA基因的扩增效率分别为2.04,2.06,1.84,1.831.93 标准曲线的测定系数范围为0.9370.999 S4列出了Q-PCR标准的序列。

   统计方法。

   进行非对偶双尾分布t检验以确定土壤和地下水样品的微生物丰富度值之间差异的统计显着性。 使用Microsoft Excel,版本14.0.6123.5001,以95%的置信水平进行t检验。

   焦磷酸序列加入链接。

   本研究中确定的pyrotag序列已保存在欧洲核苷酸文库(ENA)的简短阅读档案(SRA)中。 研究登录号为ERP002328 
 

结果:

丰富的表层土壤中的生物污染物和16S rRNA基因。

 

        在第一个时间序列(即S1A0,S1C0和S1E0)中施用粪肥之前收集的土壤样品(预处理土壤样品)比第二个时间序列中收集的预处理土壤样品(即S2A0,S2C0和S2E0)。 例如,S1A0和S1C0分别具有8.6×10 1和3.7×10 1拷贝/ ng的总生物污染物DNA,而S1E0没有可检测到的生物污染物。 对于第二个时间序列,预处理土壤样品具有2.2×10 2,2.8×10 2和8.1×10 2拷贝/ ng DNA(分别为S2A0,S2C0和S2E0)( 图3 )。 将存在于预处理土壤(即S1A0,S2A0,S1C0,S2C0,S1E0和S2E0)中的tetQ , tetZ , intI1和intI2基因与第一组后处理土壤(粪肥施用后收集的土壤) (即S1A1,S2A1,S1C1,S2C1,S1E1和S2E1)。 施用 粪肥后 ,土壤中tetZ , tetQ , intI1和intI2的总丰度从2.4×10 2增加到1.9×10 4拷贝/ ng DNA。 在生物污染物中, tetQ , tetZ , intI1和intI2水平分别增加了500倍,9倍,6倍和123倍( 图3A 3C )。 C)。 这些生物污染物的命运在不同领域有所不同。 例如, intI1和intI2的最高丰度分别为3.4×10 3和3.3×10 4拷贝/ ng DNA,分别在用C位粪肥处理的土壤样品中观察到( 图3B )。 土壤样品S1C1,S1C2,S1C3和S1C4中整合酶基因和四环素抗性基因的集体水平仍高于背景(即S1C0)高达16个月( 图3B )。 后处理土壤样品中的生物污染物的集体水平比从与地点A相关的田地收集的前处理土壤中的量保持约2倍。生物污染物的丰度在粪肥首次施用后2至3个月保持明显( 图3A )。 相反,从场地E相关田块获得的后处理土壤样品中的生物污染物丰度在1个月后降低回到预处理水平( 图3C )。 基于焦磷酸测序,土壤样品具有每ngDNA的丰度为2.4×10 4至9.3×10 7拷贝的16S rRNA基因( 图3A C ), C ),微生物丰度为447至1650OTU深度为2300个pyrotags(参见补充材料中的图S2A)。

使用土壤溶液取样器进行取样分析的结果
施用粪肥的土壤样品中检测到的16S rRNA基因,四环素抗性基因和整合子基因的总和,来自施用来自C地点的肥料的农田的土壤样品(B),土壤样品来自场地E(C)施用粪肥的农作物田和来自场地E(D)的地下水样品。 粪肥施用前收集的土壤样品以粗体突出显示。 在每个样品名称后面标明首次施用粪肥后所经过的时间。 每个井的地下水样本于2010年6月和7月在E地点收集,分别标有井名和“a”和“b”。

 

   地下水中富含生物污染物和16S rRNA基因。在E地点的大多数地下水样品中检测到生物污染物(tetZ  tetQ  intI1intI2 ),除了从第二次采样行程中收集的监测井E1和井E6E7收集的样品( 图。3D )。 在第一次采样行程中,分别从E6E7井取样的地下水样品中检测到总生物污染物的总量(4.7×10 11.5×10 4个拷贝/ ng)( 3D )。 E4监测井取回的地下水样品均为tetZ  tetQ intI1intI2阳性  E4地下水样品中tetQ的丰度比tetZ高, TetQ的丰度高达1.5×10 3 copies / ng DNA 同样,E4地下水样品中intI2的丰度比intI1高,而第一次和第二次取样行程中intI2的丰度分别为9.6×10 31.5×10 2 copies / ng DNA 3D ) 。 生物污染物也在从设施收集的地下水微生物群中很好地检测到,这些生物污染物的总丰度在第二次采样行程(3.1×10 3拷贝/ ng DNA)中比在第一次采样行程中高出200倍(1.5 ×10 1拷贝/ ng DNA)。 tetZ  tetQ  intI1intI2分别以1.6×1048.5 ×10 52.2 ×10 54.2×10 4拷贝/ ng DNA的平均丰度存在的粪肥相比,这些生物污染物的地下水水平一直较低( 3D )。 地下水样品的微生物丰度为258938 OTUs,在2300pyrotags的测序深度处确定,这与相同测序深度的粪肥相比低1.8倍(见补充材料图S2B) 。

   属与机会性病原体和粪便指标相关。

   进一步监测来自场地ACE的田间土壤样品的与机会病原体和粪便指标相关的属( 1 )。 从地点E收集的地下水样品也进行了类似的监测( 2 )。 不动杆菌属存在于大部分地下水和土壤中,相对丰度高达总微生物群落的0.69%。 其他属,如密螺旋体属, 弓形 菌属  耶尔森氏菌属和柯塞 氏菌属 ,在土壤和地下水样品中都有零星检出,相对丰度较低(<1%)。 此外,粪便细菌指标(如链球菌  葡萄球菌  丹毒丝   拟杆菌和Parabacteroides )的相关属也在土壤和地下水中普遍检测到( 12)。 2 )。 为了说明这一点,在大多数土壤中始终检测到链球菌属,尽管其相对丰度很低(0.010.11%),而在大多数土壤和地下水样品中检测到梭菌属,相对丰度范围从0.03至微生物群落的2.3%。 类杆菌和Parabacteroides也存在,特别是在从E4E7监测井取回的地下水中。 尽管不是粪便来源,但军团菌属在所有土壤和地下水样品中都可以检测到,其相对丰度范围为微生物群落总数的0.030.21%。

土壤取样结果

与土壤样品中检测到的病原体有关的属的名称和丰度
在补充材料中找到与每个属最可能栖息地有关的参考资料。
b阴影表示从现场采集的土壤样本中发生率为76%到100%,粗体字表示频率为51%到75%,斜体字表示26%到50%的频率,没有格式表示0%到25%的频率。 ND,在当前测序深度未检测到。
土壤取样分析结果


与地下水和粪便样品中检测到的病原体有关的属的名称和丰度(每个监测井n = 2)
在补充材料中找到与每个属最可能栖息地有关的参考资料。
b阴影单元表示在与相应的地下水井相关的两个样品中检测到特定的属。 ND,在当前测序深度未检测到。

      土壤和地下水微生物群落中的细菌门。图4A显示所有土壤样品主要由门杆菌 (10.7%), 酸杆菌(12.1%), 变形杆菌 (36.8%)和拟杆菌 (6.2%)以及未分类细菌(25.5%)组成。 除含有异常大量的Firmicutes和Bacteroidetes的前期土壤样品S1C0和S1E0外,施用粪肥后在门部水平土壤微生物群落没有明显变化。 Bray-Curtis相似性分析表明,无论粪肥施用后的持续时间如何,后处理土壤样品与施用粪肥前样品土壤样品(即S1A0,S2A0,S2C0和S2E0)的相似性平均为78.5%±3.0%。地下水样品中某些细菌门的丰度存在显着差异。 例如,所有地下水样品中主要含有20.9至85.6% 变形菌和3.6至48.3%未分类细菌( 图4B )。 然而,E1和E6中门杆菌酸杆菌的丰度比E4和E7中丰富6.6倍。 相比之下,E4和E7地下水具有大约11.6倍的Bacteroidetes门丰度。 Bray-Curtis相似性分析进一步显示,从监测井(即E1,E4,E6和E7)中除地下水以外的设施中回收的地下水很好地聚集在一起,并且与其他地下水的平均相似性为39.4%±1.1%地下水样品。 监测井的地下水被进一步分为两组。 为了说明这一点,从E1和E6监测井获得的地下水样品彼此之间的相似度为59.5%±0.2%,与E4和E7地下水相似度仅为42.9%±1.8%。 同样,从E4和E7监测井获得的地下水样品相互之间的相似度为53.7%±1.3%。

 

       土壤取样分析

土壤(A)和地下水(B)样品中存在细菌门的百分比丰度。 粪肥施用前收集的土壤样品以粗体突出显示。 在每个样品名称后面标明首次施用粪肥后所经过的时间。 每口井的地下水样本于20106月和7月收集,分别标上井的名称和“a”“b”


地下水样品中细菌属的差异。在属水平上的进一步评估揭示了在设施水域以及从监测井取样的两组地下水中发现的独特细菌种群( 5 )。 与其他地下水样品相比, 井内采样的地下水具有相对较高的Sulfuricurvum 1.6%), 硫酸 杆菌 2.7%)和Lysobacter 7.0%)的丰度。 E1E6地下水中门嗜酸细菌的高丰度由未培养的Gp10.2012.9%),Gp60.7611.4%)和Gp134.514.3%)组组成。 此外, 硝化螺菌属占E1地下水总微生物群落的4.3±0.1%( 5 )。 相比之下,E4E7地下水中门类 拟杆菌的丰度显着高于黄杆菌 1.7%), 类杆菌 0.3%)和Parabacteroides 0.15%)。 E4E7地下水样品中也检测到硫磺菌属 ,平均丰度分别为24.8%和6.5%,这些丰度相对高于其余地下水井中的丰度。
 
土壤溶液取样器取地下水取样分析结果

地点E地下水中存在的细菌种群热图。地下水样品被分为三组。 与每个组相关的高度丰富的细菌种群被装箱。 每口井的地下水样本于2010年6月和7月收集,分别标上井的名称和“a”和“b”。


讨论

   本研究旨在监测生猪养殖场附近的土壤和地下水生态系统中生物污染物的存在情况,并调查由于生猪活动导致的两个土着微生物群落内扰动的程度。 Q-PCR分析检测到粪肥施用后土壤环境中tetQ tetZ  intI1intI2丰度的峰值至少为6倍。 与以前的研究表明,抗生素抗性基因可以在土壤中持续长达6个月( 12,13 ),目前的研究表明,粪肥处理土壤中四环素抗性和整合酶基因的丰度可以保持在初始水平以上粪肥施用前检测到的丰度。 在某些农作物地点,例如从地点C接受粪肥的地区,升高的丰度持续长达16个月。四环素抗性类tetQ基因通常与接合转座子相关,而tetZ基因已被报道与质粒相关( 29 )。 鉴于1类和2类整合酶基因在从C位采样的土壤中被检测到并保持高达16个月的丰度,这些因素的汇合可能会产生微生物完美风暴 30 )作为一种新型微生物威胁出现频率升高并且可以创造一种环境,使传染性疾病出现并植根于社会( 30 )的现象。

   我们的研究结果进一步表明,从C位接受粪肥的土壤样品中intI1intI2的丰度最高,并且整合酶基因和四环素抗性基因的集体水平可以保持在高于背景的长达16个月的时间。 尽管没有公开确切的抗生素使用,但据报道,场所C的育苗和分娩操作典型地为母猪每天摄入0.51g金霉素,并且在大多数情况下,抗生素从育种前约1周到繁殖后大约23周( 31 )。 这些抗生素使用和牲畜管理措施可能可能归因于检测到的生物污染物的持续水平。

   位于E点附近的粪肥泻湖(即E4E6E7)的地下水监测井在两次取样行程中至少有一次取样时对四环素抗性和整合酶基因呈阳性。 与此相反,背景监测井E1位于废弃的泻湖上,对这些生物污染物呈阴性。 这些观察结果表明,从泄漏的泻湖衬里浸出粪便相关的污染物,而这些污染物又被水平传播到位于浅层深处的地下水井。 E1井相似,该设施井位于废水泻湖的上坡。 然而,我们在设施中检索到的地下水中发现了四环素抗性基因和整合酶基因。 来自场地E的设施的地下水经常用于清洁和消费。 进一步加重问题的是,位于E点的私人水井通常不受美国EPA标准的限制,并且在使用前可能不会定期消毒( 32 )。 设施井和监测井E1之间的差异是两个井位于含水层中的深度(2 )。 该井井深36.6米,而E1井钻至5.3米的较浅深度。 设施井但不在E1井中检测到四环素抗性和整合酶基因,表明粪便相关污染物存在一定程度的垂直渗漏,这可能进一步影响地下水供应。例如,浸出可能发生在含有约25m肥料浆的废弃物坑的底部。 根据当地的水文地质情况,渗滤液可以在初始阶段水平扩散,然后以垂直方式扩散到达与设施连接良好的深层含水层。 另外,由于设施井中的地下水是从水龙头供应中采集的,生物污染物的积极检测可能是由于管道分配网络中的妥协。 未来的研究将不得不包括水文地质和工程调查以确定这些推论。 另外,未来的研究应该旨在从设施和地下水中分离四环素耐药菌。 分离这些细菌物种将提供对这些抗性特征是否确实从猪粪便微生物群水平获得的见解。

   基于四环素抗性和整合酶基因的丰度,推测设施井和监测井E4E7受影响的程度要比井E1E6相对更大。 地下水微生物群中存在与生物污染物丰度相对应的分化。 设施井和监测井E4E7中的地下水微生物群显示出高含量的硫铁矿  硫酸 锰和硫酸   5 )。 这些细菌群能够氧化猪粪中含有的硫,还可以利用硝酸盐作为电子受体( 33-35 )。 先前的一项研究在E井监测井( 5 )中检测到设施井中约140毫克/SO 4 2-287856毫克/SO 4 2- ,并且这些量高于粪肥(70.7毫克/升),这可能表明这些细菌属于地下水中的活性硫氧化活性。 在地下水中也检测到与粪便相关的细菌群(如链球菌和拟杆菌 )( 2 )。 加上过去在场地E进行的细菌学调查发现存在粪大肠菌群和粪链球菌( 5 ),这些观察结果重申粪位污染存在于场地E的地下水中,并且这种污染可能来自猪场( 36 ) 。

   然而,与地下水井不同,这些井与废水泻湖密切相关,因此暴露于不断的粪便污染源,土壤样品仅接受一次粪肥应用产生的污染脉冲。 这些短暂的污染脉冲对土壤微生物群的微生物组成没有可察觉的影响。 已经证明,粪肥中的细菌对土壤微观世界的适应性很差,并很快超过了土壤微生物群( 13 )。 同样,土壤微生物群落多样性与致病性大肠杆菌种群生存之间的负相关也已被证明( 37)。与这些观察结果相一致,本研究中的土壤样品的微生物丰度显着高于地下水(P= 4.23×10-6),而较高的土壤微生物多样性可能对植入细菌群体对微扰的适应能力更强在应用的猪粪中。负相关可能是由于入侵病原体利用土壤中存在的可用资源的竞争能力下降。另外,由于粪便中的细菌在土壤中持续暴露于太阳光的全部紫外线光谱下,所以来自粪肥的细菌可能会比地下水中的细菌死亡率更高。

   在每个样品约5990序列的当前焦磷酸测序深度,它显露土壤和地下水样品含有宽范围与机会致病菌(相关联的属的1AND2)。 2 )。其中一些属是人类机会病原体(如不动杆菌属,耶尔森氏菌和肠球菌),而另一些是机会主义人类和动物病原体(如梅毒螺旋体,弓形,贝氏,金黄色葡萄球菌,和丹毒丝菌)。这些与机会致病菌相关的属可进一步分为三类:第一类是密螺旋体属,军团菌属,耶尔森氏菌属和柯塞氏菌属,它们含有细胞内寄生虫并存在于宿主中;第二,属ArcobacterAcinetobacterClostridiumEnterococcus,来源于环境和粪便来源;第三,属链球菌,葡萄球菌属,丹毒丝菌属,Parabacteroides,和拟杆菌,这主要来源于粪便来源。其中,不动杆菌属存在于粪肥,土壤和地下水生态系统中,相对丰度高达总微生物群落的0.69%。不动杆菌属通常被认为是共生的,机会主义的,相对低等级的病原体(38),但现在已经被确定为社区获得性感染的病例病原体和院内感染(93940)。除了不动杆菌外,在粪便,土壤和地下水生态系统中也检测到粪便相关细菌,如链球菌,丹毒丝菌和拟杆菌,表明来自生猪生产活动的入侵物种对土壤和地下水环境造成了扰动。

   最后,在一些粪肥处理的土壤和从监测井E4E7取样的地下水中也检测到细胞内寄生物,如耶尔森氏菌和柯塞氏菌。已知细菌物种鼠疫耶尔森氏菌和伯氏柯氏疟原虫分别是瘟疫和Q热的病原体。对小鼠进行的剂量反应实验已经证实,鼠疫耶尔森氏菌和伯氏考克斯体的半数致死剂量(LD 50 s)分别约为4.26×10 2 CFU41)和4.93×10 8 PFU42), 分别。鉴于在土壤和地下水中只检测到耶尔森菌属和考克斯菌属的相对丰度低,对农场工作者和公众的潜在健康影响仍然很低。此外,本研究中短焦磷酸测序长度(〜370核苷酸[nt])不允许在物种水平进行鉴定,因此我们无法确定是否存在鼠疫耶尔森氏菌和伯氏考克斯氏体。

   总之,这项研究表明,土壤和地下水都容易受到来自养猪场的污染。粪便处理的土壤和粪便污染的地下水可能是水平基因转移的热点,并且可能是物种丰富的环境微生物群和抗生素抗性微生物之间遗传物质交换的关键区域。未来的研究应旨在通过使用分子和栽培方法来评估水平基因转移的方向,并确定抗菌素耐性土壤和地下水细菌与机会病原体之间是否存在可能的流动遗传元素交换。这项研究提供了生物污染物(即四环素抗性基因,整合酶基因,这两种生态系统都有机会致病菌和粪便相关细菌)。再加上我们最近对牲畜生产农场的室内生物气溶胶的监测工作(24)中,我们的研究结果重申需要更好的管理实践和法规,以尽量减少源自猪场的生物污染物向环境的传播。


 

 

 

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